Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, abgekürzt HPLC, ist ein Trennverfahren, bei dem ein Probengemisch unter hohem Druck durch eine Säule gepresst und in seine Bestandteile zerlegt wird. Sie ist die Grundlage der modernen Spurenanalytik in Haar, Urin und Blut. Für sich allein ist sie jedoch kein Nachweisverfahren – entscheidend ist, was danach detektiert.

Trennung und Detektion sind zwei Schritte

Die Säule sorgt dafür, dass die Bestandteile eines Extrakts zu unterschiedlichen Zeiten austreten. Was am Ende gemessen wird, hängt vom Detektor ab. Ein einfacher UV-Detektor registriert nur, dass zu einem bestimmten Zeitpunkt etwas eluiert – er identifiziert nichts. Für forensische Zwecke genügt das nicht. Anhang C der GTFCh-Richtlinien hält für Haarproben ausdrücklich fest, dass nur eine gaschromatographische oder eine HPLC-Methode in Verbindung mit einem massenspezifischen Detektor beziehungsweise einem Tandem-Massenspektrometer in Betracht kommt. Die Kopplung von HPLC und Massenspektrometrie ist als LC-MS beziehungsweise LC-MS/MS geläufig.

Abgrenzung zu GC-MS

Merkmal	GC-MS	LC-MS/MS
Trennprinzip	gasförmige mobile Phase	flüssige mobile Phase unter hohem Druck
Probenvorbereitung	Derivatisierung bei nichtflüchtigen oder polaren Analyten erforderlich	ohne Derivatisierung möglich
Typische Analyten	flüchtige und derivatisierbare Verbindungen	polare Substanzen, Glucuronide, Spurenkonzentrationen
Einsatzschwerpunkt	strukturidentifizierende Bestätigung	Standard für Haar- und Niedrigkonzentrationsanalytik im Pikogrammbereich

Die Wahl ist keine Frage der Qualität, sondern der Aufgabe. Für THC-Carbonsäure im Haar etwa wurden mit einem gaschromatographischen Verfahren sehr niedrige Verfahrensgrenzen von 0,02 pg/mg als Nachweisgrenze und 0,05 pg/mg als Bestimmungsgrenze beschrieben, während flüssigkeitschromatographische Verfahren dort teils erst bei 1 pg/mg ansetzten. Umgekehrt kommt LC-MS/MS ohne den Derivatisierungsschritt aus und ist für Ethylglucuronid und andere polare Marker das Verfahren der Wahl.

Warum die Bestätigung ein zweites Verfahren braucht

Ein Immunoassay ist klassenbezogen und liefert nur einen Hinweis. Die GTFCh formuliert dazu die Grundregel, dass positive Resultate hinweisgebender Analysen isoliert genommen nicht gerichtsverwertbar sind und durch ein zweites unabhängiges, spezifisches und identifizierendes Verfahren mit mindestens gleicher Empfindlichkeit bestätigt werden müssen; ein immunchemisches Ergebnis kann nicht durch einen zweiten Immunoassay bestätigt werden. Genau diese Rolle füllt die massenspektrometrisch gekoppelte Chromatographie aus. Das Konsenspapier der Society of Hair Testing verlangt für die Bestätigung ebenfalls chromatographische Methoden in Kopplung mit Massenspektrometrie.

Was im Befund stehen sollte

Aussagekräftig wird ein Ergebnis erst mit Angabe des verwendeten Verfahrens, der validierten Bestimmungsgrenze und der Messunsicherheit. Für die Haaranalytik ist eine harmonisierte Messunsicherheit von plus/minus 30 Prozent beschrieben, die bei Entscheidungen nahe am Cut-off zugunsten der betroffenen Person zu berücksichtigen ist. Alle eingesetzten Verfahren sind vor dem Gebrauch zu validieren; das ist Bestandteil der Akkreditierung nach DIN EN ISO/IEC 17025 für forensische Zwecke.

Häufige Fragen

Ist HPLC dasselbe wie LC-MS/MS?

Nein. HPLC bezeichnet die Trennung, LC-MS/MS die Kombination aus dieser Trennung und einem Tandem-Massenspektrometer als Detektor. Erst die Kopplung macht das Verfahren identifizierend.

Welches Verfahren ist genauer?

Beide erreichen forensische Anforderungen, wenn sie validiert sind. Für polare Substanzen und sehr niedrige Konzentrationen ist LC-MS/MS in der Regel praktikabler, weil die Derivatisierung entfällt.

Kann ich verlangen, dass mit einem bestimmten Verfahren gemessen wird?

Maßgeblich ist, dass das eingesetzte Verfahren validiert und vom Akkreditierungsumfang gedeckt ist. Die Methodenwahl trifft das Labor im Rahmen dieser Vorgaben.